Resumos

REVISÃO / REVIEW

Biologia molecular do processo de infecção por Agrobacterium spp.

Molecular biology of the infection process by Agrobacterium spp.

Gisele M. de Andrade^I; Laudete M. Sartoretto^II; Ana C. M. Brasileiro^III

Laboratório de Transferência de Genes, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, CEP 70849-970, Brasília, DF

^IEndereço atual: School of Forest Resources, University of Georgia, Athens (GA) – EUA

^IIEndereço atual: Laboratório de Biotecnologia Florestal, Departamento de Ciências Florestais, Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria (RS)

^IIIEndereço atual: Embrapa Labex-France, Cirad-Amis - TA 70/03, Avenue Agropolis, 34.398 Montpellier Cedex 5 – França, Telefone: 00.33.(0)4.67.61.57.35, Fax: 00.33.(0)4.67.61.56.05, e-mail: brasileiro@cirad.fr

RESUMO

Agrobacterium tumefaciens é o agente causal da galha-da-coroa, doença que afeta a maioria das plantas dicotiledôneas e caracteriza-se pelo crescimento de tumores na junção entre o caule e a raiz (coroa). A formação desses tumores é o resultado de um processo natural de transferência de genes de Agrobacterium spp. para o genoma da planta infetada. Esses genes estão contidos em um plasmídio de alto peso molecular (120 a 250 kb), denominado Ti ("tumor inducing"), presente em todas as linhagens patogênicas de Agrobacterium spp. Duas regiões do plasmídio Ti estão diretamente envolvidas na indução do tumor: a região-T, que corresponde ao segmento de DNA transferido para a célula vegetal, e a região de virulência (região vir), que contém genes envolvidos na síntese de proteínas responsáveis pelo processo de transferência da região-T. Esta região, uma vez transferida e integrada no genoma da célula vegetal, passa a ser denominada de T-DNA ("transferred DNA"). Os genes presentes no T-DNA codificam enzimas envolvidas na via de biossíntese de reguladores de crescimento, auxinas e citocininas. A síntese desses reguladores pelas células transformadas causa um desbalanço hormonal, levando à formação do tumor no local da infecção. Outro grupo de genes presentes no T-DNA codifica enzimas responsáveis pela síntese de opinas, que são catabolisadas especificamente pela bactéria colonizadora, como fonte de nutrientes. O conhecimento preliminar das bases moleculares envolvidas no processo de infecção de uma planta hospedeira por Agrobacterium spp., permitiu a utilização desta bactéria como vetor natural de transformação genética de plantas.

Palavras-chave adicionais: biovares, oncogenes, opinas, T-DNA, plantas trasgênicas, plasmídio Ti, tumores em plantas.

ABSTRACT

Agrobacterium tumefaciens is the causal agent of crown gall disease that affects most dicotyledonous plants and is characterized by growth of tumors in the region between the plant stem and root (crown). The development of tumors is the result of a natural transfer process of Agrobacterium spp. genes to the genome of the infected plant. These genes are found on a high molecular weight plasmid denominated Ti (tumor inducing), present in all pathogenic Agrobacterium spp. strains. Two Ti plasmid regions are directly involved in tumor induction. The T-region, which corresponds to the segment of transferred DNA to the plant cells, and the virulence (vir) region, which contains genes involved in the synthesis of proteins required for T-region transfer. This region, when transferred and integrated to the plant cell genome, is called T-DNA (transferred DNA). The genes present in T-DNA encode enzymes involved in the biosynthesis of plant growth regulators, auxin and cytokinin. The synthesis of these regulators by transformed cells results in a hormonal inbalance, leading to the development of tumors where the infection took place. Another group of genes present in T-DNA encodes enzymes required for opine synthesis, which are specifically catabolised by the colonizing bacterium as the source of nutrients. Preliminary knowledge of the molecular basis involved in the infection process of the host plant by Agrobacterium spp. allowed the use of this bacterium as a natural vector for plant genetic transformation.

INTRODUÇÃO

A galha-da-coroa (do inglês crown gall) tem-se destacado nos últimos anos entre as doenças bacterianas de plantas, não pela importância econômica dos prejuízos causados por ela, mas pelo impacto que o estudo dessa doença trouxe para a ciência moderna. Apesar de ser conhecida desde a Antigüidade, somente em 1907, o seu agente etiológico foi descrito pela primeira vez como sendo Agrobacterium tumefaciens (Smith &Townsend) Conn. Essa doença caracteriza-se pela formação de galhas na coroa (junção entre o caule e a raiz) ou diretamente nas raízes da planta infetada. O interesse de cientistas trabalhando nos mais diferentes campos da pesquisa por esta doença deveu-se ao fato de que nas galhas vegetais, normalmente causadas por microrganismos ou insetos, a proliferação do tecido vegetal é induzida por um estímulo externo, de natureza química ou mecânica. No caso da galha-da-coroa, as células vegetais infetadas por Agrobacterium spp. adquirem a propriedade de multiplicarem-se de maneira autônoma, sem a necessidade de estímulos externos. Inicialmente, os pesquisadores associaram o desenvolvimento da galha-da-coroa ao câncer animal, o que estimulou numerosas pesquisas visando a elucidação dos seus mecanismos de indução e formação. Esses estudos concluíram que a formação da galha-da-coroa é, na realidade, o resultado de um processo natural de transferência de genes da bactéria para a célula vegetal, que passam a sintetizar proteínas que estimulam a divisão celular no sítio de infecção. Os conhecimentos gerados desde então culminaram com um entendimento bastante aprofundado desse parasitismo, sendo considerado atualmente um sistema-modelo para estudos das interações patógeno-hospedeiro em plantas.

A BACTÉRIA

As agrobactérias (Agrobacterium spp.) são microrganismos tipicamente do solo e Gram-negativas. Não formam esporos e possuem forma de bacilo, medindo 0,6-1,0 x 1,5-3,0 µm, e com um a seis flagelos peritríquios. Em geral, as agrobactérias são aeróbicas, apresentando o oxigênio como aceptor final de elétrons. Alguns isolados podem ter respiração anaeróbica, em presença de nitrato, outros podem sobreviver em ambientes com baixa tensão de oxigênio, como no interior dos tecidos de plantas hospedeiras. A temperatura ótima de crescimento está na faixa de 25 a 28 °C, com colônias geralmente convexas, circulares, lisas, apigmentadas ou de coloração levemente creme (Holt et al., 1994).

Dentro do gênero Agrobacterium (do grego agros = campo e bakterion = bastonete), cinco espécies já foram descritas: (i) A. tumefaciens, que provoca a doença conhecida como galha-da-coroa; (ii) A. rhizogenes (Riker et al.) Conn. que causa a síndrome da raiz em cabeleira (do inglês "hairy root"); (iii) A. rubi (Hildebrand) Starr & Weiss, que induz tumores em Rubus spp.; (iv) A. vitis Ophel & Kerr que induz tumores em Vitis spp. e (v) A. radiobacter (Beijerinck & van Delden) Conn., que são bactérias não-patogênicas. As agrobactérias pertencem à família Rhizobiaceae, que agrupa, entre outros, o gênero Rhizobium que são bactérias fixadoras de nitrogênio (Kersters & De Ley, 1984).

As diferentes espécies do gênero Agrobacterium ocorrem em todo o mundo, em quase todos os tipos de solos, cultivados ou não e, especificamente, na rizosfera das plantas contaminadas onde são encontradas nas galhas, nas raízes ou no solo adjacente. Mesmo em solos com elevada incidência da galha-da-coroa, A. radiobacter é sempre mais numerosa (de dez a 100 vezes) do que as outras espécies patogênicas. As agrobactérias são mais encontradas em regiões de clima temperado devido à sua sensibilidade às altas temperaturas (Lippincott et al., 1981).

Mais de 600 espécies vegetais são conhecidamente susceptíveis à infecção por Agrobacterium spp., pertencendo, a maioria delas, à classe das Angiospermas dicotiledôneas e Gymnospermas e, mais raramente, às Angiospermas monocotiledôneas (De Cleene & De Ley, 1976). Embora sua incidência seja baixa, a galha-da-coroa pode tomar proporções devastadoras em certas culturas, conduzindo à perda quase total da produção, principalmente em espécies propagadas vegetativamente, como ornamentais, frutíferas e florestais.

No Brasil, os primeiros relatos sobre doenças causadas por espécies de Agrobacterium surgiram na década de 70 em Minas Gerais. Neste estado, a galha da roseira surgiu primeiramente em algumas propriedades e depois, devido às práticas agronômicas adotadas para esta cultura, como a propagação vegetativa e enxertia, ocorreu uma rápida disseminação do patógeno (Romeiro, 1995). Hoje, existem relatos de sérios danos causados por Agrobacterium spp. em vários estados do País, especialmente em roseiras (Rosa sp.) e videiras (Vitis vinifera L.) (Beriam et al., 1996). Entretanto, a galha-da-coroa não é considerada uma doença de importância econômica no Brasil.

Linhagens não-patogênicas de Agrobacterium spp. já foram ocasionalmente isoladas de seres humanos, causando infecções em pacientes severamente debilitados. Entretanto, não existem evidências que as agrobactérias sejam patógenos de vertebrados (Dunne et al., 1993; Alnor et al., 1994; Southern Jr., 1996).

BIOVARES

A atual classificação das agrobactérias, baseada apenas na sua fitopatogenicidade, tem um valor taxonômico questionável, pois a virulência de linhagens de Agrobacterium spp. é determinada por um plasmídio conjugativo. Como estes plasmídios podem ser perdidos em situações de estresse ou adquiridos por conjugação bacteriana, alguns autores sugerem que é preferível utilizar a classificação baseada somente nas características determinadas pelo cromossomo. Assim, as espécies de Agrobacterium estão subdivididas em pelo menos três biovares, de acordo com suas características bioquímicas, fisiológicas e nutricionais, determinadas pelos genes cromossomais. Entretanto, a divisão em biovares nem sempre é possível, uma vez que várias linhagens apresentam características intermediárias. Desta forma, nos últimos anos, a classificação das agrobactérias vem sofrendo uma série de críticas e sugestões de alteração, de modo que a taxonomia do gênero Agrobacterium continua ainda controvertida (Kersters & De Ley, 1984; Holt et al., 1994; Beriam et al., 1996). Além do que, o recente seqüenciamento completo dos plasmídios Ti e Ri mostrou que os mesmos são altamente conservados, mesmo entre espécies diferentes (Zhu et al., 2000; Moriguchi et al., 2001).

A biovar 1, o maior grupo, compreende a maioria das linhagens de A. tumefaciens e de A. radiobacter. Estas linhagens possuem uma grande capacidade de adaptação e podem ser isoladas de diferentes tipos de solo. Já as linhagens pertencentes à biovar 2 são mais exigentes em relação às condições de solo e são restritas em suas associações com as plantas hospedeiras. Neste grupo, encontram-se algumas linhagens de A. tumefaciens e um grande número de A. rhizogenes. O último grupo, a biovar 3, compreende basicamente A. vitis que infeta videira (Ophel & Kerr, 1990). As poucas linhagens identificadas como A. rubi apresentam características bioquímicas intermediárias entre as três biovares (Lippincott et al., 1981).

PLASMÍDIO Ti

Agrobacterium tumefaciens é considerada a espécie-tipo do gênero Agrobacterium e foi descrita pela primeira vez por Smith e Townsend (1907), como Bacillus tumefaciens. Posteriormente, o gênero Agrobacterium foi proposto por Conn e enquadrado na família Rhizobiaceae (Conn, 1942). A galha-da-coroa, provocada pela infecção por A. tumefaciens, foi primeiramente descrita por Aristóteles e Theophrastus na Antigüidade e é caracterizada pelo crescimento de galhas na raiz ou na coroa da planta (Siemens & Schieder, 1996). Essas galhas, quando isoladas, são capazes de crescer indefinidamente em meio de cultura in vitro, sem reguladores de crescimento (White & Braun, 1941). Devido a esta característica, muito semelhante a das células oncogênicas, o interesse em estudar essas galhas aumentou enormemente, visando descobrir os mecanismos moleculares e celulares envolvidos no crescimento incontrolado de células e, consequentemente, possibilitar o desenvolvimento de novos remédios e terapias para o câncer animal (Hooykaas & Schilperoort, 1992). Entretanto, os estudos realizados demonstraram que a formação de galhas induzidas por A. tumefaciens estava diretamente associada à presença de um plasmídio de alto peso molecular (120 a 250 kb), denominado plasmídio Ti (do inglês "tumor inducing"). Este plasmídio está presente somente em linhagens patogênicas de Agrobacterium spp., em um baixo número de cópias, e podem ser transferidos via conjugação para outras bactérias (Hamilton & Fall, 1971; van Larebeke et al., 1974; Zaenen et al., 1974; Watson et al., 1975).

Na década de 70, a descoberta de que a indução das galhas por Agrobacterium spp. era resultante de um processo natural de transferência de genes do plasmídio Ti para o genoma da planta infetada, deu um novo incentivo às pesquisas nesta área (Stafford, 2000). Assim, duas regiões no plasmídio Ti envolvidas diretamente no processo de indução tumoral foram identificadas (Figura 1): a região-T, que corresponde ao segmento de DNA transferido para a célula vegetal, e a região de virulência (região vir), que contém genes envolvidos na síntese de proteínas responsáveis pelo processo de transferência da região-T (Stachel & Nester, 1986).

A região-T é delimitada por seqüências repetidas de 25 pb, conhecidas como extremidades direita e esquerda, e, uma vez integrada no genoma da célula vegetal, passa a ser denominada T-DNA (do inglês "transferred DNA"). Os genes presentes no T-DNA passam então a expressar-se, codificando enzimas envolvidas na via de biossíntese de reguladores de crescimento (auxinas e citocininas). A expressão destes genes interfere no balanço hormonal das células transformadas, resultando na sua multiplicação descontrolada, levando, assim, à formação da galha, ou tumor, nos sítios infetados da planta (Tzfira & Citovsky, 2000; Zupan et al., 2000).

O T-DNA também possui genes que codificam enzimas responsáveis pela síntese de opinas, que são compostos formados pela condensação de aminoácidos ou carboidratos modificados e que serão catabolisadas somente pela linhagem indutora, como fonte de nutrientes. Desta forma, as células transformadas pelo T-DNA continuam dividindo-se incontroladamente devido à produção de citocininas e auxinas e, quanto mais elas dividem-se, mais elas produzem opinas que vão sendo utilizadas pela bactéria indutora, formando um nicho extremamente favorável a ela (Binns et al., 1992; Hooykaas & Beijersbergen, 1994).

Além da região-T e da região vir, três outras regiões funcionais, não envolvidas diretamente no processo de indução tumoral, foram também identificadas no plasmídio Ti, são elas (Figura 1): (i) região de replicação (região rep), que contém a origem de replicação e funções ligadas à manutenção do plasmídio Ti dentro da bactéria (estabilidade), controle do número de cópias e incompatibilidade entre bactérias; (ii) região de absorção e catabolismo de opinas (região opc), envolvida na síntese de enzimas específicas responsáveis pela absorção das opinas para dentro da célula e posterior catabolismo das mesmas pela bactéria, e (iii) região de transferência conjugativa (regiões tra e trb), responsável pela transferência conjugativa do plasmídio Ti entre linhagens de Agrobacterium spp. ou para outras bactérias Gram-negativas. A maioria dessas regiões é altamente conservada entre os diferentes tipos de plasmídio Ti, principalmente aqueles pertencentes à mesma classe de opinas.

Essas cinco regiões cobrem aproximadamente dois terços do plasmídio Ti (Figura 1). No restante do plasmídio, novos genes foram identificados, incluindo genes homólogos ao mutT, nodQ e ligE, que estão provavelmente ligados à determinação do espectro de hospedeiro (Suzuki et al., 2000). O plasmídio Ti também possui genes reguladores (repressores, antagonistas, ativadores, etc.) que codificam proteínas que vão regular a expressão de outros genes do plasmídio Ti. A presença de elementos IS (Insertion Sequences) no plasmídio Ti também foi relatada, embora a transposição desses elementos ainda não tenha sido demonstrada experimentalmente (Zhu et al., 2000). Existem ainda outras funções presentes no plasmídio Ti que ainda não são conhecidas, mas que, provavelmente, não estão diretamente envolvidas no processo de desenvolvimento do tumor (Hooykaas & Schilperoort, 1992; Hooykaas & Beijersbergen, 1994).

TRANSFERÊNCIA DA REGIÃO-T PARA A CÉLULA VEGETAL

Indução do sistema de virulência

O processo de infecção e transferência da região-T para a célula vegetal ocorre em diferentes etapas (Figura 2). A primeira delas inicia-se pelo reconhecimento e fixação da bactéria no tecido vegetal lesado por tratos culturais, geadas ou insetos. As agrobactérias são atraídas em direção à célula vegetal por quimiotactismo positivo em relação a moléculas-sinal (essencialmente compostos fenólicos, aminoácidos e monossacarídeos) que são exsudadas pelas células da planta ferida (Tzfira & Citovsky, 2000). Uma vez em contato com a célula vegetal, as bactérias sintetizam filamentos de celulose que estabilizam a ligação inicial, propiciando uma melhor fixação entre a bactéria e a célula hospedeira (Matthysse et al., 2000). Desta forma, a motilidade e o quimiotactismo têm um papel fundamental no processo inicial de infecção, visto que, sem o contato bactéria-célula vegetal, o evento de transferência de DNA não ocorreria (Winans, 1992; Sheng & Citovsky, 1996).

Acredita-se que existam receptores específicos para Agrobacterium spp. na superfície da célula da planta, pois um número finito de agrobactérias é capaz de ligar-se a estas células. Além disso, outros gêneros de bactérias não são capazes de competir por esses sítios de ligação. Os genes envolvidos na interação agrobactéria-célula vegetal estão localizados no cromossomo da agrobactéria e incluem chvA, chvB, pscA (ou exoC), att, chvD, chvE, miaA, ros, chvG, chvI e acvB. Mutações em qualquer um desses loci, interferem na ligação agrobactéria-célula vegetal e resultam em linhagens incapazes de infetar plantas (Matthysse & McMahan, 1998; Gelvin, 2000). Outras proteínas e carboidratos da superfície celular vegetal estão, provavelmente, envolvidos na interação com Agrobacterium spp. Entretanto, a identidade destes receptores ainda não foi determinada (Hooykaas & Beijersbergen, 1994; Sheng & Citovsky, 1996).

Estando a ligação inicial estabilizada, as moléculas-sinal exsudadas em resposta ao ferimento da planta vão também ativar a expressão dos genes de virulência que estão localizados na região vir do plasmídio Ti. A região vir é formada por um conjunto de seis a mais operons (conhecido como regulon vir), contendo, aproximadamente, 34 genes no total. Os operons da região vir são co-regulados por duas proteínas da própria região vir, VirA e VirG, que são induzidas, de maneira coordenada, em resposta a estímulos químicos (moléculas-sinal). Isso significa que, após o reconhecimento extracelular, o sinal químico é convertido em uma resposta intracelular.

A primeira demonstração da indução dos genes vir por diferentes compostos exsudados de tecidos vegetais lesados foi realizada em co-cultura de fumo (Nicotiana tabacum L.) com A. tumefaciens (Stachel & Zambryski, 1986a). Na mesma época, as primeiras moléculas-sinal (acetosiringona e hidroxi-acetosiringona) foram identificadas como potentes indutores dos genes vir (Stachel et al., 1985). O pH extracelular ácido e a presença de açúcares (como glicose e galactose) e de aminoácidos foram também caracterizados como ativadores da região vir (Winans et al., 1994). Desses estímulos, os compostos fenólicos são os mais importantes indutores da virulência da agrobactéria. O pH ácido (5,2 a 5,8) e açúcares não são capazes de estimular a indução na ausência de compostos fenólicos, mas são considerados fortes potenciadores da indução. Estes indutores químicos são característicos de tecidos vegetais lesados: compostos fenólicos e açúcares são precursores de importantes componentes da parede celular como lignina e celulose e, como os vacúolos ocupam a maior parte do volume celular, e são geralmente ácidos, a seiva exsudada tende a ser ácida (Winans, 1992; Sheng & Citovsky, 1996).

As proteínas VirA e VirG pertencem a uma classe de proteínas conhecidas como sistema regulatório de dois componentes ("two-component regulatory system"). Em tal sistema, a proteína VirA funciona como uma proteína sensora, enquanto a proteína VirG age como um ativador transcricional por ligar-se a regiões promotoras dos operons vir, iniciando assim o processo de transferência da região-T (Hooykaas & Beijersbergen, 1994; Winans et al., 1994).

A VirA é uma histidina quinase presente na membrana interna da bactéria. Dos estímulos químicos já mencionados, os açúcares ativam indiretamente VirA através da proteína periplasmática ChvE, que liga-se a açúcares. O complexo formado pela proteína ChvE-açúcar interage então com o domínio periplasmático de VirA (Cangelosi et al., 1990). Por outro lado, os compostos fenólicos parecem interagir diretamente com VirA (Lee et al., 1995). Na presença desses estímulos químicos, a proteína VirA autofosforila o resíduo de histidina 474, que é um resíduo específico e altamente conservado na família das quinases. O grupamento fosfato ligado a este resíduo pode ser então transferido diretamente para o resíduo específico de aspartato 52, altamente conservado na proteína VirG. Uma vez fosforilada, a proteína VirG, que localiza-se no citoplasma bacteriano, passa de sua forma inativa para sua forma ativa (Hooykaas & Beijersbergen, 1994; Winans et al., 1994).

Para ativar a sua própria expressão e a dos demais operons vir, a proteína VirG ativada liga-se ao vir box, uma seqüência específica e altamente conservada de 12 pb presente na região promotora de cada operon vir (Jin et al., 1990). Assim, a ligação com VirG é necessária para ativação dos operons da região vir, embora o real papel da fosforilação de VirG ainda não foi determinado, visto que a proteína VirG não-fosforilada também liga-se especificamente ao vir box. A fosforilação poderia aumentar a afinidade de ligação com o DNA e/ou permitir interações com outras proteínas importantes no processo transcricional, como a RNA polimerase (Winans et al., 1994; Sheng & Citovsky, 1996).

Formação do complexo-T

Após a ativação da expressão dos operons vir, inicia-se o processo de transferência da região-T para a célula vegetal. Os operons virD e virC estão envolvidos nas primeiras etapas desse processo.

As proteínas VirD1 e VirD2, codificadas pelo operon virD, são essenciais para o reconhecimento e clivagem da região-T (Yanosfsky et al., 1986). A proteína VirD1 apresenta alta afinidade pelas seqüências de 25 pb das extremidades da região-T e também possui atividade topoisomerase (Ghai & Das, 1989). Assim, VirD1 poderia reconhecer as extremidades da região-T e, ao mesmo tempo, converter o DNA para a forma relaxada, expondo as seqüências específicas de clivagem para a proteína VirD2, que tem uma atividade endonucleásica e também reconhece especificamente os 25 pb de cada extremidade da região-T (Yanosfsky et al., 1986). A primeira clivagem por VirD2 ocorre na extremidade 5' direita, entre a terceira e quarta base da fita inferior (Wang et al, 1987). Após a clivagem, a proteína VirD2 liga-se covalentemente a essa extremidade 5' direita clivada através do resíduo de tirosina 29 (Herrera-Estrella et al., 1988; Pansegrau et al., 1993). Uma segunda clivagem na extremidade 3' esquerda, leva à liberação da fita inferior da região-T, que continua associada à proteína VirD2 na extremidade 5' direita. Esta molécula de DNA linear, fita simples, obtida após o deslocamento da fita inferior da região-T, é denominada fita-T. Desta forma, o deslocamento da fita-T ocorre na direção 5' - 3' da fita inferior da região-T, iniciando na extremidade direita e terminando na extremidade esquerda, indicando a existência de polaridade no processamento da fita-T (Zambryski et al., 1989).

Uma vez liberada a fita-T, uma cópia da fita inferior da região-T é sintetizada a partir da extremidade direita (direção 5' - 3'), utilizando a fita superior como molde. A síntese continua até atingir o sítio de clivagem da extremidade 3' esquerda. Embora as proteínas VirD1 e VirD2 estejam envolvidas diretamente no processo de clivagem, não existe nenhuma evidência experimental que indique que VirD1 permaneça associada à fita-T, como VirD2 (Binns et al., 1992; Zambryski, 1992; Hooykaas & Beijersbergen, 1994; Sheng & Citovsky, 1996).

À medida que a fita inferior vai separando-se da fita superior da região-T, a proteína VirE2 liga-se covalentemente e de maneira não-específica à mesma (Gietl et al., 1987). VirE2 é uma proteína codificada pelo operon virE que possui alta afinidade por fita simples de DNA, isto é, é uma proteína de ligação à fita simples de DNA ["single strand" DNA "binding (SSB) protein"] (Christie et al., 1988). Esta ligação é extremamente forte e cooperativa, levando à formação de um complexo muito estável entre a fita-T e VirE2. A relativa abundância de VirE2 e sua alta afinidade por fita simples de DNA poderiam permitir sua rápida ligação à fita-T, durante sua formação, protegendo-a da degradação por nucleases, além de evitar o dobramento da mesma (Citovsky et al., 1989). Um modelo foi então proposto, onde a ligação entre VirE2 e a fita-T resulta na formação de uma estrutura rígida e cilíndrica, semelhante a um fio de telefone (Citovsky et al., 1997). A formação desta estrutura é especialmente importante para o transporte da fita-T através dos poros nucleares. Assim, embora, o operon virE não seja essencial para o processo de transferência da fita-T para a célula vegetal, ele é importante para a eficiência desse processo (Binns et al., 1992).

As proteínas VirC1 e VirC2, codificadas pelo operon virC, ligam-se especificamente a uma seqüência conservada, localizada próxima à extremidade direita da região-T, denominada "overdrive" (ou região ode). A exata função das proteínas VirC não é conhecida. No entanto, acredita-se que o complexo formado entre VirC1-overdrive favorece a correta orientação das proteínas VirD1 e VirD2 para o reconhecimento dos sítios de clivagem, aumentando desta forma a eficiência no processo de clivagem e transferência da fita-T (Toro et al., 1988, 1989). Várias outras enzimas, como helicases, polimerases e enzimas de reparo são também necessárias para a produção da fita-T e são codificadas, provavelmente, por genes do cromossomo bacteriano (Zambryski, 1992; Zhu et al., 2000).

O mecanismo pelo qual a fita-T deixa a célula bacteriana, penetra na célula vegetal e integra-se no seu genoma nuclear, é pouco conhecido (Zupan et al., 2002). Sabe-se que, para a fita-T chegar até o núcleo da planta, ela precisa atravessar membranas, paredes celulares e espaços inter e intracelulares. Acredita-se que a fita-T é transportada da bactéria para a célula vegetal, como um complexo nucleoprotéico, conhecido como complexo-T e formado pela fita-T protegida na extremidade 5' por VirD2 e envolvida por vários monômeros de VirE2 (Citovsky et al., 1989).

Transporte intercelular do complexo-T

A primeira etapa do transporte intercelular do complexo-T consiste na sua passagem através da membrana da agrobactéria. Trabalhos iniciais demonstraram que o operon virB era necessário para a virulência, mas não para a etapa de formação da fita-T. A análise das seqüências de aminoácidos das proteínas VirB permitiu identificar algumas de suas características físicas, localização celular e possíveis funções (Zambryski, 1992; Zupan et al., 2000). A maioria das 11 proteínas codificadas pelo operon virB exibe características de proteínas de membrana, como seqüências hidrofóbicas e/ou seqüências-sinal. Estudos posteriores confirmaram a localização de proteínas VirB na membrana interna e externa de Agrobacterium spp. (Thorstenson et al., 1993). Assim, algumas das proteínas VirB poderiam formar uma estrutura funcionalmente similar a um canal, ou poro conjugal, necessária para o transporte do complexo-T (Ward et al., 1988; Zupan et al., 1998). Duas proteínas, VirB4 e VirB11, ambas associadas à membrana interna da bactéria, possuem atividade ATPase. Essas proteínas poderiam fornecer a energia necessária para o transporte do complexo-T através da membrana da agrobactéria (Berger & Christie, 1993).

As interações que ocorrem entre o complexo-T e as proteínas VirB são pouco conhecidas. Estudos de comparação de seqüências identificaram algumas das proteínas do operon virB semelhantes às proteínas envolvidas no processo de transferência conjugativa de plasmídios entre bactérias (Lessl & Lanka, 1994). Este processo requer um poro ou canal através do qual o DNA plasmidial atravessa a membrana da célula doadora e alcança a célula receptora (Winans et al., 1996). Assim, supõe-se que a VirD4, uma proteína ancorada na membrana interna da agrobactéria, seria o produto que intermediaria a ligação do complexo-T ao canal VirB, auxiliando na translocação entre a bactéria e a célula hospedeira (Okamoto et al., 1991; Lessl & Lanka, 1994).

Estudos recentes indicam que a proteína VirE1 parece funcionar como uma chaperona e é necessária para o transporte da proteína VirE2 para fora da célula bacteriana (Sundberg et al., 1996; Deng et al., 1999). Estudos recentes sugerem que a proteína VirE2 é exportada para fora da célula bacteriana separadamente do complexo fita-T:VirD2 e a formação do complexo-T só seria completada dentro do citoplasma da célula vegetal (Zupan et al., 2000). Entretanto, estudos adicionais serão necessários para confirmar esta hipótese.

Transporte intracelular do complexo-T

O aparato VirB libera o complexo-T dentro do citoplasma da célula vegetal. Entretanto, outras etapas são necessárias para o transporte do complexo-T até o nucleoplasma e sua integração no genoma nuclear. Provavelmente, existam receptores na membrana celular vegetal que possam estar auxiliando a entrada do complexo-T no citoplasma da célula vegetal. Entretanto, o mecanismo que possibilita a entrada do complexo-T no núcleo da célula da planta é pouco caracterizado. A possibilidade do complexo-T entrar por difusão passiva no núcleo da planta foi excluída, pois o tamanho limite estimado para o mesmo, aproximadamente 50 kDa, excede o tamanho do poro nuclear. Além disso, a entrada de moléculas no núcleo da célula é um processo extremamente seletivo, que requer a ativação de proteínas presentes no poro nuclear, sugerindo desta forma, que o transporte do complexo-T seja feito de forma ativa (Citovsky & Zambryski, 1993). Esta ativação é mediada por uma seqüência-sinal de localização nuclear (NLS) presente na própria molécula a ser transportada ou em moléculas associadas a ela. Como a fita-T não possui seus próprios sinais de direcionamento, sua importação para o núcleo da célula vegetal é provavelmente mediada pelas proteínas da agrobactéria que a acompanham em sua odisséia, i.e., as proteínas VirD2 e VirE2. A proteína VirD2 contém uma seqüência homóloga ao tipo bipartido de NLS, previamente descrita em outras proteínas, e que é funcionalmente ativa em animais e plantas (Tinland et al., 1992). Todavia, a eliminação de alguns aminoácidos da seqüência NLS de VirD2 em linhagens de Agrobacterium spp. reduziu, mas não aboliu, a capacidade de induzir tumores em plantas.

A proteína VirE2 tem também um papel importante no transporte nuclear do complexo-T, pois a virulência de linhagens de Agrobacterium spp. com VirE2 inativada foi restaurada após inoculação em plantas transgênicas expressando a proteína VirE2 (Ward & Zambryski, 2001). VirE2 possui duas seqüências NLS, ambas requeridas para um eficiente transporte do complexo-T para o núcleo da célula (Lartey & Citovsky, 1997). Trabalhos sugeriram que VirE2 poderia ser capaz de, sozinha, mediar o transporte do complexo-T para dentro do núcleo da célula da planta (Zambryski, 1992). Esta hipótese está baseada no fato de VirE2 fornecer várias seqüências NLS ao longo de todo o complexo-T (aproximadamente 600 monômeros), facilitando dessa maneira uma importação ininterrupta do complexo-T para o núcleo da célula. Além disso, fita simples de DNA (ssDNA) fluorescente foi localizada no núcleo da célula vegetal apenas quando microinjetada como um complexo com a proteína VirE2 (ssDNA-VirE2) (Zupan et al., 1996). Quando o DNA foi microinjetado sozinho (ssDNA), o mesmo permaneceu no citoplasma. Assim, o modelo proposto para o transporte do complexo-T pela membrana nuclear sugere que VirD2 poderia orientar e iniciar a entrada do complexo-T no poro, enquanto os vários monômeros de VirE2 dirigiriam sua passagem pelo poro nuclear (Lartey & Citovsky, 1997; Tzfira et al., 2001; Ziemienowicz et al., 2001; Ward et al., 2002).

Enquanto muitas das proteínas de Agrobacterium spp. envolvidas no processo de transporte do complexo-T já foram caracterizadas, pouco é conhecido sobre os fatores celulares vegetais que participam deste processo. Foi constatado que a proteína VirD2 interage in vivo e in vitro com uma proteína de Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold denominada AtKAPa, a qual pertence à família das carioferinas a (Ballas & Citovsky, 1997). Este receptor medeia, provavelmente, a importação do complexo-T para o núcleo, mediante interação com a seqüência NLS presente na proteína VirD2. Diferentemente da VirD2, a proteína VirE2 não interage com o receptor AtKAPa, sugerindo que outro receptor deva interagir com esta proteína. Foi também constatado que a proteína VirD2 interage in vivo e in vitro com três proteínas de A. thaliana pertencentes à família das ciclofilinas, que são altamente conservadas em plantas, animais e procariotos (Deng et al., 1998). Embora a função biológica das ciclofilinas não esteja clara na infecção por Agrobacterium spp., elas são conhecidas por atuar como chaperonas, que poderiam preservar a conformação da proteína VirD2 quando no citoplasma da célula hospedeira ou durante a importação e/ou integração da fita-T no genoma da planta (Deng et al., 1998).

Integração da fita-T no genoma da planta

A etapa final do processo de transferência do complexo-T consiste na sua integração no genoma nuclear da célula hospedeira. Todavia, os mecanismos moleculares envolvidos nesta etapa são ainda pouco conhecidos. Ao contrário de outros elementos móveis, como transposons, o T-DNA não codifica nenhuma proteína envolvida na sua própria integração. Assim, a integração da fita-T no genoma vegetal pode ser mediada pelas proteínas VirD2 e VirE2, em combinação com proteínas da própria célula hospedeira (Tinland, 1996; Tzfira et al., 2000).

Mutações realizadas na proteína VirD2 provocaram alterações no padrão de integração da extremidade 5' do T-DNA no genoma da célula hospedeira. Embora estas mutações tenham reduzido a eficiência de transferência do complexo-T, as mesmas não afetaram a eficiência da integração da fita-T no genoma da célula vegetal (Tinland et al., 1995). Estes resultados sugerem que a proteína VirD2 participa da ligação da extremidade 5' da fita-T no DNA da planta, mas esta ligação não é um fator limitante para o processo de integração. Além da VirD2, a proteína VirE2 pode também estar envolvida no processo de integração da fita-T. Esta proteína, além de proteger fisicamente a fita-T da ação de nucleases vegetais, pode ser requerida para a integração da sua extremidade 3' com o DNA da planta (Ward & Zambryski, 2001).

Os poucos dados existentes na literatura não permitem tirar conclusões definitivas sobre o padrão de integração da fita-T no cromossomo de plantas transformadas por Agrobacterium spp.Todavia, dados obtidos com diferentes espécies vegetais indicam que os sítios de integração são randômicos, isto é, não existe uma preferência por determinado cromossomo ou por regiões específicas dentro do cromossomo. Entretanto, algumas evidências sugerem que a fita-T integra-se preferencialmente em regiões do cromossomo que são transcricionalmente ativas (Tinland & Hohn, 1995).

Os sítios de ligação da fita-T com o DNA de plantas transgênicas de A. thaliana foram seqüenciados e analisados, permitindo tirar algumas conclusões: (i) a integração da fita-T não é sítio-específica e não requer longos trechos de homologia; (ii) a integração da fita-T leva a pequenas deleções do DNA da planta no sítio de inserção (menos que 100 bp); (iii) a parte 3' esquerda do T-DNA é pouco conservada e também possui uma curta região de homologia com o sítio de pré-inserção (pelo menos cinco nucleotídeos contíguos); (iv) a parte 5' direita do T-DNA é frequentemente conservada até o nucleotídeo que é clivado na bactéria (Gheysen et al., 1991). Em alguns casos, a homologia com o sítio de pré-inserção está restrita a uma ou poucas bases (microhomologia). Outra observação interessante é que, uma vez dentro do núcleo, a fita-T torna-se fita dupla com o concomitante deslocamento de VirE2, antes da sua integração.

A partir destas e outras observações, alguns modelos para integração da fita-T no genoma da planta foram propostos. O primeiro deles sugere que a integração de cada uma das extremidades da fita-T no DNA da planta ocorra por recombinação ilegítima (Gheysen et al., 1991). Neste modelo, a ligação da extremidade 5' direita da fita-T ao DNA da planta ocorre primeiro, seguida da ligação da extremidade 3'esquerda. Outro modelo propõe que a integração da fita-T inicia-se pela extremidade 3' da fita-T através do anelamento de seqüências de 2 a 5 pb (microhomologia) expostas à seqüência complementar do DNA da planta (Tinland et al., 1995; Mysore et al., 1998). Outra hipótese é que a ligação com a fita-T (na forma fita dupla) ocorreria através do reparo das pontas de uma quebra da fita dupla do DNA da planta (Zupan et al., 2000). Esta hipótese é bastante consistente com vários arranjos observados como resultado da integração da fita-T. Em qualquer dos casos, a integração das extremidades 5' e 3' parece ser auxiliada pela maquinaria da planta. Recentemente, o primeiro fator da planta (histona H2) envolvido na integração da fita-T foi identificado, confirmando o envolvimento de proteínas estruturais vegetais neste processo (Mysore et al., 2000). Desta forma, a replicação do DNA e a atuação das enzimas de reparo da planta são importantes para auxiliar na integração da fita-T no genoma vegetal.

Outros genes da região vir

Alguns genes do regulon vir não são essenciais para a tumorigênese em todos os hospedeiros e alguns são necessários somente em hospedeiros específicos ou têm uma função auxiliar na transferência da região-T. Esses genes incluem virD3; -D5; -E3; -F; -H; -J; -K; -L; -M; -P e –R (Kalogeraki et al., 2000; Nester, 2000; Zhu et al., 2000). VirF é uma proteína encontrada em algumas linhagens de Agrobacterium spp. e parece estar envolvida com espectro de hospedeiro. Assim como as proteínas VirD2 e VirE2, a proteína VirF penetra na célula hospedeira, onde, por um mecanismo ainda pouco conhecido, altera o espectro de hospedeiro da linhagem indutora. O operon virH possui dois genes que, por análise de seqüência, parecem codificar monooxigenases do tipo P450. Mutações em ambos os genes tiveram um efeito mínimo na virulência. Estudos com a proteína VirD3 concluíram também que a mesma não é necessária para a transformação da célula vegetal.

SEMELHANÇAS COM A CONJUGAÇÃO BACTERIANA

Várias evidências suportam a hipótese de uma relação evolucionária comum entre a transferência de DNA para plantas mediada por Agrobacterium spp. e a transferência conjugativa de plasmídios entre bactérias. Esta hipótese foi proposta pela primeira vez após a descoberta da fita-T (Stachel & Zambryski, 1986b). Neste trabalho, os autores compararam os dois sistemas de transferência de DNA, sugerindo analogias funcionais entre oriT (origem de transferência conjugativa) e as extremidades da região-T, e os genes tra (requeridos para o processo de reconhecimento e transferência do plasmídio) e a região vir. Desde então, análises detalhadas do processo de transferência conjugativa têm fornecido evidências que confirmam essa analogia entre os dois sistemas. Entre os processos comuns estão o contato célula-célula, o início da transferência do DNA e o seu transporte através das membranas. Essas semelhanças incluem proteínas com seqüências de aminoácidos similares e/ou com equivalência de funções, organização gênica e propriedades físicas das enzimas envolvidas (Lessl & Lanka, 1994; Zupan & Zambryksi, 1995; Moriguchi et al., 2001). Como exemplo, evidências sugerem forte correlação entre as proteínas VirD1/VirD2 do plasmídio Ti e as proteínas TraI/TraJ envolvidas na conjugação bacteriana (Pansegrau et al.,1993). Em ambos os sistemas, similaridades funcionais têm sido observadas, como clivagem sítio-específica e ligação covalente da proteína à extremidade 5' após a clivagem.

EXPRESSÃO DOS GENES DO T-DNA NA CÉLULA VEGETAL

Uma vez inseridos no genoma da planta, os genes presentes na região-T, agora denominada T-DNA, passam a ser transcritos e traduzidos, dando início ao desenvolvimento do tumor. Todos os genes do T-DNA, apesar de sua origem procariota, possuem sinais de regulação que são reconhecidos pela maquinaria de transcrição eucariota vegetal, incluindo TATA e CAAt "boxes", "enhancers" transcricionais e cauda poli(A). Assim, os genes do T-DNA são expressos ao mesmo tempo e da mesma maneira que os genes da planta. O estudo da expressão dos genes do T-DNA identificou diversos transcritos presentes no tumor, codificando proteínas cujas funções foram sendo aos poucos elucidadas. Entre os genes estudados, distinguem-se, de um lado, os genes responsáveis pelas propriedades tumorais (ou oncogenes) e os genes responsáveis pela síntese de opinas.

Os oncogenes

Os oncogenes (iaaM, iaaH, ipt, 5 e 6b), presentes na região-T do plasmídio Ti de A. tumefaciens, estão diretamente envolvidos na formação da galha durante o processo de infecção pela bactéria (Schröder et al., 1984). Os genes iaaM e iaaH, presentes no lócus tms ("tumour morphology shooty"), codificam enzimas que estabelecem uma via alternativa de biossíntese de auxinas (ácido indolacético, AIA) nas células transformadas (Schröder et al., 1984; Thomashow et al., 1986). Por outro lado, o gene ipt, presente no lócus tmr, codifica uma isopentenil-transferase que catalisa a primeira etapa de biossíntese de precursores de citocinina (Barry et al., 1984). A expressão desses três oncogenes causa um desequilíbrio hormonal nas células transformadas, levando à sua multiplicação descontrolada, e resultando na formação dos tumores. Por isso, quando isolados da planta e cultivados em meio de cultura sem reguladores de crescimento, esses tumores são capazes de crescer indefinidamente devido à sua produção endógena de hormônios vegetais (Hooykaas & Schilperoort, 1992).

Além dos genes iaaM, iaaH e ipt, que são diretamente responsáveis pelo desenvolvimento do tumor, a região-T possui outros oncogenes (genes 5 e 6b) envolvidos em uma fina regulação do balanço de auxina/citocinina no tumor, tendo em vista que a presença de altos níveis desses hormônios de crescimento podem levar à morte celular. Ensaios realizados in vitro sugerem que o gene 5, na presença de altas concentrações de auxina, codifica uma indole-3-lactate que converte o triptofano em ácido indol-láctico (ILA). Desta forma, o ILA, que é um análogo de auxina, compete pela ligação com proteínas envolvidas na transdução de sinal de auxinas, reduzindo os níveis desse hormônio no tumor (Körber et al., 1991). Por outro lado, o gene 6b (também conhecido como tml) aumenta a sensibilidade das células vegetais aos hormônios da planta, por um mecanismo ainda desconhecido (Spanier et al., 1989; Tinland et al., 1989, 1990).

O fenótipo final do tumor depende, assim, da proporção de auxinas e citocininas sintetizadas pelas células transformadas e dos níveis endógenos desses reguladores no sítio de infecção (Steffen et al., 1986; Stafford, 2000). Como conseqüência deste desbalanço hormonal, as células transformadas proliferam desordenadamente, levando à formação de um tumor, conhecido como galha-da-coroa. Em A. rhizogenes, a expressão dos oncogenes induz a produção de raízes no local do ferimento, devido, provavelmente, a um aumento da sensibilidade à auxina nas células transformadas. O sintoma então observado é conhecido como raiz em cabeleira (Meyer et al., 2000).

Os genes de síntese de opinas

Outros genes presentes no T-DNA codificam enzimas envolvidas na via da biosíntese de opinas, que são compostos formados pela condensação de aminoácidos ou carboidratos modificados (Dessaux et al., 1993). As opinas produzidas nos tumores pelas células transformadas são secretadas para as regiões intercelulares do tumor e metabolizadas especificamente pela linhagem de Agrobacterium sp. indutora do tumor (Ellis et al., 1979). Desta forma, as linhagens patogênicas de Agrobacterium spp. podem ser classificadas de acordo com o tipo de opina sintetizada pelo seu T-DNA, como por exemplo: octopina, nopalina, agropina, cucumopina, manopina, etc. (Brasileiro & Lacorte, 1998). Existem, descritos na literatura, pelo menos 20 tipos diferentes de opinas e cada linhagem de Agrobacterium sp. sintetiza e catalisa um grupo específico de opinas (Chilton et al., 2001). As opinas não são metabolizadas pelas células da planta, mas servem como principal fonte de carbono e nitrogênio para a agrobactéria infetante. O catabolismo destas opinas requer enzimas específicas. Como estas enzimas só são codificadas pelo plasmídio Ti da agrobactéria indutora do tumor, nenhum outro microrganismo do solo pode catabolisá-las, criando assim um nicho biológico favorável para o crescimento desta bactéria (Binns et al., 1992; Hooykaas & Beijersbergen, 1994).

Essa pressão seletiva favorece a multiplicação da linhagem indutora da galha que, por sua vez, irá reinfetar as células vegetais que ainda não foram transformadas. Além disto, as opinas estimulam a transferência conjutiva do plasmídio Ti para linhagens não-patogênicas (sem plasmídio Ti) de A. radiobacter e, conseqüentemente, são responsáveis pelo aumento de população bacteriana capaz de utilizar essas opinas como fonte de nutrientes. Assim, a síntese de opinas pelas células vegetais infetadas e seu catabolismo pela bactéria indutora da galha tiveram provavelmente um papel muito importante na disseminação do plasmídio Ti na natureza. A teoria que propõe a atuação das opinas como intermediárias químicas do parasitismo (ou colonização genética), é conhecida como o "conceito de opinas" (Guyon et al., 1980; Dessaux et al., 1993).

Outros genes do T-DNA

Até hoje, nenhuma função pode ser atribuída com certeza à parte esquerda do T-DNA das linhagens do tipo nopalina (transcritos a, b, c, d e e) ou aos transcritos 7, 3' e 4' das linhagens do tipo octopina. De qualquer maneira, sabe-se que esses genes podem ser deletados do T-DNA, sem que isso modifique visivelmente o fenótipo do tumor.

CONCLUSÃO

O conhecimento das bases moleculares do mecanismo de infecção por Agrobacterium spp. contribuiu enormemente para um melhor entendimento das relações patógeno-hospedeiro, assim como permitiu avanços consideráveis em outras áreas da pesquisa como virologia, transporte inter- e intracelular, sistemas de secreção de moléculas, conjugação bacteriana, entre outros. Por outro lado, o desenvolvimento de técnicas em biologia celular e molecular vegetal abriu novas perspectivas para as pesquisas sobre a transferência de genes exógenos para plantas, utilizando Agrobacterium spp. como vetor natural de transformação. A transferência de genes de origens distintas para diferentes espécies vegetais foi possível graças ao desenvolvimento de vetores derivados do plasmídio Ti e sua introdução em linhagens desarmadas de Agrobacterium spp., onde os oncogenes foram eliminados. A alta eficiência de transformação, o baixo custo operacional, assim como a simplicidade dos protocolos de transformação, são as maiores razões para a universalidade do uso do sistema Agrobacterium spp.

Atualmente, diferentes características de interesse sócio-econômico já foram introduzidas em diferentes espécies vegetais por transformação genética através do sistema Agrobacterium spp. Essas características visam principalmente o melhoramento do desempenho em campo das plantas cultivadas, através da resistência a estresses bióticos e abióticos. Características relacionadas ao desenvolvimento da planta e à qualidade do produto também podem ser modificadas em plantas transgênicas. A tendência é que cada vez um maior número de características possa ser manipulado via engenharia genética, aumentando a gama de produtos a serem disponibilizados para o agricultor e o consumidor. Em um futuro breve, as plantas transgênicas desempenharão também o papel de biofábricas, desenvolvidas para a produção de produtos de interesse para as indústrias de medicamentos, de alimentos ou de rações.

Além de todas as implicações para a agricultura e outros setores da economia, as plantas transgênicas constituem também um excelente sistema para estudos básicos em diferentes campos da biologia, como fisiologia, genética, botânica, biologia molecular e celular.

Aceito para pulbicação em 12/05/2003

Autor para correspondência: Ana Cristina M. Brasileiro

Datas de Publicação