ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

Agregados amiloides: rol en desórdenes de conformación proteica

Amyloid aggregates: role in protein misfolding disorders

 

Claudia Duran-Aniotz ^1,2,a, Inés Moreno-Gonzalez ^1,b, Rodrigo Morales ^1,b

¹Mitchell Center for Alzheimer’s disease and related Brain Disorders, Department of Neurology, University of Texas Medical School at Houston, 6431 Fannin Street, Houston, Texas, 77030, USA.
²Universidad de los Andes, Facultad de Medicina, Av. San Carlos de Apoquindo 2200, Las Condes, Santiago, Chile.
^aM.Sc
^bPh.D.

Correspondencia a:

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Misfolding and aggregation of proteins are the main features of a group of diseases termed Protein Misfolding Disorders (PMDs). PMDs include Alzheimer's disease and Transmissible Spongiform Encephalopathies, among many others. The deposition of protein aggregates is the main responsible for tissue damage and the consequent clinical signs generated in such disorders. In this review, we will focus in the role of protein aggregates in these diseases and in the putative mechanisms by which they exert their toxicity.

(Rev Med Chile 2013; 141:495-505).

Key words: Alzheimers disease; Amyloid; Prion diseases; Protein misfolding; Protestasis deficiencies.

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Las proteínas deben adquirir un plegamien-to adecuado, el cual depende tanto de su secuencia aminoacídica como de la maquinaria presente en la célula. Los procesos anormales de plegamiento, inducidos por diversas situaciones de estrés en el ambiente intra- o extra-celular, mutaciones u otros eventos, pueden resultar en la pérdida de las funciones fisiológicas de la proteína o en la generación de estructuras tóxicas para la célula, provocando acontecimientos patológicos¹³. Los eventos de plegamientos anómalos (conocidos como protein misfolding) que desembocan en la agregación de proteínas en tejidos específicos¹, han sido asociados a muchas enfermedades. Debido al origen común desde el punto de vista molecular, este grupo de enfermedades se ha denominado desórdenes de conformación proteica (DCP). Los DCP incluyen muchos síndromes clínicos como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington (EH), la diabetes tipo-2 (DT2) y las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) o enfermedades producidas por priones, entre otras¹.

Se ha sugerido que la deposición de agregados proteicos en estas enfermedades es el principal responsable de los daños tisulares y de los con secuentes cuadros clínicos generados. Los mecanismos por los que estas estructuras ejercen sus efectos no han sido completamente descritos en la actualidad. Las proteínas que constituyen los agregados proteicos en los DCP son específicas de cada una de las enfermedades en las que están implicadas, causando múltiples efectos en diferentes tejidos. De esta forma, el péptido -amiloide (A) y la proteína tau están involucrados en la EA; la proteína del prion con una conformación anormal (conocida como PrP^Sc),en las EET; la -sinucleína, en la EP; y la huntingtina, en la EH. Considerando el incremento de la población de edad avanzada y que muchas de estas enfermedades están íntimamente asociadas al envejecimiento, se estima que el número de pacientes afectados por algún DCP aumentará considerablemente en los próximos años⁴. Si tomamos en cuenta estos pronósticos y el hecho de que en este momento no existen métodos diagnósticos o terapéuticos efectivos para estas enfermedades, la investigación biomédica enfocada a entender las bases moleculares de estas condiciones patológicas es de vital importancia.

En esta revisión nos enfocaremos en el papel y mecanismos por los cuales los agregados proteicos ejercen su actividad y, en consecuencia, desenca denan los DCP. Nos centraremos principalmente en dos tipos de DCP por su prevalencia e interés a nivel biomédico: la EA y las EET.

Bases moleculares de los desórdenes de conformación proteica: el modelo de nucleación-polimerización

En los DCP, los agregados proteicos o "amiloides" se componen de diferentes proteínas, sin embargo, estas estructuras son similares desde el punto de vista morfológico y bioquímico. Desde un enfoque estructural, las proteínas presentes en este tipo de organizaciones se caracterizan por tener plegamiento del tipo , favoreciendo la hidrofobicidad y la agregación en estructuras específicas denominadas hoja -plegada^1,5. Esta disposición conformacional, confiere a las proteínas resistencia a proteólisis, desnaturalización y a mecanismos generales de eliminación presentes en la célula. Los factores celulares que pueden guiar estos procesos de plegamiento anómalo han sido parcialmente identificados. Entre ellos, quizás el más importante, está relacionado con las diferencias en la secuencia proteica. Se ha descrito que sustituciones puntuales en la secuencia aminoacídica promueven una conformación ami-loidogénica, la cual puede favorecer la agregación y la subsecuente progresión patológica⁶.

Los procesos de agregación proteica en estas enfermedades se caracterizan por ser lentos y organizados. Uno de los modelos más aceptados para la formación de estructuras amiloidogénicas es el de nucleación-polimerización^3,7. Brevemente, este modelo propone una cinética particular definida por dos fases disímiles de agregación³ (Figura 1 ). La primera de ellas, denominada fase de retardo o lag phase, involucra los primeros eventos de formación de "núcleos" o "semillas" de polimerización a expensas de intermediarios solubles o formas aberrantes (por ejemplo, mutantes) de estas proteínas. La formación de estas pequeñas estructuras oligoméricas da paso a la segunda fase en este proceso (o fase exponencial), donde el reclutamiento exponencial de nuevas unidades a los agregados previamente formados, resulta en una gran carga de estructuras amiloides, las cuales se distribuyen en un amplio espectro de organizaciones como pequeños oligómeros, protofibras, fibras y, en algunos casos, placas amiloides^5,8.

Figura 1. Modelo de nucleación-polimerización en la formación de estructuras amiloides. La conformación nativa de una proteína (A), normalmente ligada a una adecuada función biológica, está en equilibrio con muchas otras conformaciones posibles. Entre ellas, formas parcialmente plegadas (B) pueden desembocar en estructuras anómalas (C-E) asociadas a los DCP. En el proceso de agregación de estas proteínas se distinguen dos etapas predominantes. La primera (fase de retardo) incluye la generación de os primeros núcleos de agregación, mientras que la segunda (fase exponencial) corresponde al crecimiento de estas unidades a partir de los núcleos de agregación previamente formados. Las proteínas anómalamente plegadas en estas enfermedades se distribuyen comúnmente en estructuras que incluyen pequeños oligómeros (C), protofibras (D), y agregados fibrilares inso-ubles (E). La adición de agregados previamente formados es capaz de inducir la oligomerización de unidades monoméricas solubles, evento que acorta la fase de retardo y que explica parcialmente los mecanismos de infectividad existentes en las EET.

A pesar de la relación existente entre este tipo de agregados y el desarrollo de la enfermedad, los mecanismos por los que se produce el típico daño celular en estas patologías es aún un tema controvertido. Estudios recientes sugieren que los oligómeros solubles serían las especies más tóxicas en estas enfermedades⁹. En base a estos resultados, se ha postulado que grandes agregados compuestos de fibras y placas amiloides podrían actuar como un mecanismo de defensa al atrapar estas partículas tóxicas y encapsularlas, reduciendo su actividad citotóxica¹⁰.

Teorías de la disfunción y muerte celular en los desórdenes de conformación proteica

Las manifestaciones clínicas observadas en los DCP son la consecuencia de una serie de alteraciones presuntamente producidas por las proteínas con conformación anómala. Estas alteraciones están directamente relacionadas con la disfunción y la muerte celular. En la actualidad, se han descrito tres hipótesis que explicarían los daños tisulares y sistémicos generados en estas enfermedades: i) pérdida de la función normal ejercida por la proteína; ii) ganancia en toxicidad de los nuevos agregados moleculares generados; e iii) inducción de procesos inflamatorios (Figura 2 ).

Figura 2. Mecanismos propuestos para el daño tisular causado por los agregados amlloldes en los DCP. La pérdida de la función normal de la proteína, la ganancia de toxicidad de nuevas conformaciones y la inducción de procesos inflamatorios, son los mecanismos propuestos de cómo los agregados proteicos ejercen su función en los DCP. Por una parte, estos cambios conformacionales pueden resultar en la pérdida de las funciones fisiológicas específicas de una proteína, evento que podría causar daños considerables en el organismo. Alternativamente, estos cambios estructurales pueden concluir en la producción y acumulación de entidades tóxicas, sensibilizando a la célula ante eventos de estrés que pueden terminaren su muerte. Además, la nueva conformación adquirida por estas proteínas puedeinteractuar con diferentes receptores de la superficie neuronal o con elementos de la microglíayastrocitos, desencadenando cascadas transduccionales nocivas para la célula (ver texto). La combinatoria de todos estos eventos, que desembocan en la muerte o disfunción celular, posteriormente genera una descompensación tisular y sintomatología específica, lo que en la gran mayoría de los casos potencia o concluye en la muerte del individuo.

Hipótesis de pérdida de la función

Una de las hipótesis en relación a la progresión clínica y patológica en los DCP es que la proteína involucrada, al adquirir una nueva conformación, perdería su función original, produciéndose así un quiebre en procesos esenciales para el desarrollo y supervivencia celular. En la esclerosis lateral amiotrófica, la pérdida en la funcionalidad de la superóxido dismutasa-1, podría proporcionar una susceptibilidad excesiva de las células ante eventos de estrés oxidativo¹¹. Para otras proteínas, como el péptido A en la EA o la proteína celular del prion (PrP^c) en las EET, su función biológica no ha sido descrita satisfactoriamente^12,14.

Numerosas funciones le han sido atribuidas a la PrP, entre las que destaca su asociación en funciones de neuroprotección, ya sea como receptora^15,16, transductora^17,18 o como molécula antioxidante^19,20. Diversos estudios muestran que la PrP es capaz de reducir la tasa de muerte celular tras exposición a estrés oxidativo y, por el contrario, su deficiencia produce un aumento de la misma^21,24. Otros estudios han descrito que las repeticiones de octapéptidos en su región N-terminal son capaces de unir iones de cobre divalente, relacionando así a la PrP^c con la homeostasis de este catión en la zona sináptica²⁵. De hecho, pacientes afectados con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) presentan un aumento de hasta 50% en los niveles de ion cobre cerebral²⁶. Adicionalmente, varias proteínas han sido asociadas a PrP, dentro de las cuales destacan importantes moléculas transductoras como Bcl-2, Hsp60, STI1, Fyn, PKA, PBK/Akt, entre otras^16,27. Por otro lado, la PrP^c ha sido relacionada con eventos pro-apoptóticos, complicando aún más este escenario²⁸. Recientemente, se ha descrito a la PrP^c como un receptor de oligómeros tóxicos de A¹⁵, hallazgo que también ha suscitado controversias²⁹. Sin embargo, hasta el momento, la única función clara de la PrP^c es ser la fuente a partir de la cual los priones infecciosos son generados, ya que los animales que carecen de esta proteína son viables y completamente resistentes a la infección mediada por PrP^Sc30.

Para el caso de la proteína precursora amiloide (PPA), molécula a partir de la cual se forma el A, el panorama es distinto. Una de las funciones atribuidas a esta proteína es, al igual que para la PrP, la capacidad de unir ion cobre³¹. Otras propiedades asociadas son la de actuar como factor de crecimiento³², mediador de adhesión celular^33,34, regulador intraneuronal de calcio³⁵ y receptor celular³⁶. Además, el (3A ha sido asociado como sustrato proteolítico de la proteína degradadora de la insulina, confiriéndole propiedades en la regulación de este importante metabolito³⁷. Los animales deficientes en la PPA presentan anomalías motoras, que podrían tener su origen en deficiencias nerviosas y/o musculares^38,39. Adicionalmente, estos animales también presentan otras características neuropatológicas como neuroinflamación³⁹ y fallos en la memoria a largo plazo^38,40,41, pero en ningún caso una condición patológica que simule a la EA.

En conclusión, para las patologías de nuestro interés, no es posible afirmar si la pérdida de la función proteica es la causa de la progresión patológica. Lo que es claro es que en ningún caso la ausencia de estas moléculas explica satisfactoriamente la sinaptotoxicidad y muerte neuronal observadas. Es por ese motivo que la hipótesis de la ganancia de la toxicidad es la más aceptada en la actualidad.

Hipótesis de la ganancia de toxicidad

Una de las teorías fundamentales acerca de la muerte neuronal en las EET y en otros DCP señala a que la nueva conformación adquirida por la proteína involucrada podría tener efectos tóxicos para la célula^42,44. En la gran mayoría de los DCP, la acumulación del confórmero mal plegado ejercería la cito toxicidad observada¹. En general, la muerte celular en estas patologías puede ocurrir por diversas rutas, sin embargo, la apoptosis es el principal evento implicado⁴⁴. Distintos trabajos en modelos animales de EET muestran una clara activación apoptótica^45,49. Estos estudios han sido complementados analizando tejidos obtenidos de pacientes⁵⁰, confirmando la existencia de moléculas características de procesos apoptóticos.

Como ha sido descrito en muchos experimentos realizados in vitro, la región 106-126 de la PrP se encuentra altamente relacionada con la neurotoxicidad en las EET^51,52. Este fragmento es rico en estructura (3 y es parcialmente resistente a la acción de la proteinasa K, características clásicamente asociadas a los priones infecciosos. Los procesos de muerte celular relacionados con este péptido están relacionados a un aumento de los niveles de Ca²⁺ en el espacio citoplasmático⁴⁶ y a la despolarización de membranas, posiblemente generada por la formación de canales iónicos⁵³. Estos eventos son seguidos por la activación de la calpaína y posterior disfunción mitocondrial, lo que concluye en la activación de la caspasa-3⁵². Evidencia adicional sugiere que la PrP es capaz de activar una respuesta reticular característica ante proteínas mal plegadas, la que finalmente desemboca en eventos apopléticos⁴⁶. Adicionalmente, los fragmentos de A (A₄₀ y A₄₂) fisiológicamente relevantes con conformación amiloidogénica han sido reportados como citotóxicos^54-58. Así como en las EET, rutas similares de muerte celular han sido asociadas al A en la EA^44,59-62.

Análisis post mortem de cerebros de pacientes afectados con las enfermedades de Alzheimer, Creutzfeldt-Jakob e insomnio fatal familiar, muestran que la deposición proteica no se encuentra siempre relacionada con la pérdida neuronal. El hecho de si el responsable de la toxicidad celular observada es realmente la acumulación de la proteína anómalamente plegada o un intermediario soluble, aún se desconoce⁶³. La identificación reciente de oligómeros como las partículas más nocivas en estas enfermedades ha abierto nuevas puertas tanto para la investigación básica como en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para combatir a estas enfermedades^64,68.

Inducción de procesos inflamatorios

El sistema inmunológico juega un rol esencial en el mantenimiento de la homeostasis tisular, confiriendo al organismo protección frente a agresiones tanto internas como externas. Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan, en general, por la aparición de un severo proceso neuroinflamatorio⁶⁹. En el cerebro, la mayoría de las células inmunes residentes son las células mi-crogliales (macrófagos), las cuales están en constante actividad⁷⁰. Las células astrogliales, además de tener funciones de soporte, también intervienen en la respuesta inflamatoria. En consecuencia, la microglía y los astrocitos son las principales células que participan en la respuesta neuroinflamatoria.

Al inicio de la enfermedad, esta reacción inflamatoria es necesaria y beneficiosa para el organismo, pero cuando ésta se produce de forma exacerbada y/o crónica puede causar graves daños titulares e incluso agravar el desarrollo de la enfermedad.

En particular, los agregados proteicos de A y PrP^Sc, son los responsables directos o indirectos de la existencia de un proceso inflamatorio, determinado por una activación de la microglía y la posterior producción de citoquinas pro-inflamatorias, así como por la aparición de astrocitos reactivos, que pueden generar productos tóxicos que inducen muerte neuronal, tales como citoquinas inflamatorias, aminoácidos excitadores y especies reactivas de oxígeno (ERO)^71-74.

Bajo condiciones fisiológicas, la microglía se encuentra en estado de reposo, asociado con la producción de factores anti-inflamatorios⁷⁰. En respuesta a la acumulación o agregación proteica, la microglía se activa y es reclutada hacia la zona donde se encuentran estos agregados⁷⁰. Muchas veces, esta respuesta inflamatoria involucra la migración de células circulantes periféricas al cerebro. Después de la activación, la microglía aumenta la expresión de factores pro-inflamatorios como citoquinas, quimioquinas y proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad, relacionadas con la presentación antigénica⁷⁵. La correcta activación microglial, seguida de una apropiada activación linfocitaria, tiene efectos neuroprotectores, favoreciendo la fagocitosis de células muertas, la eliminación de productos de desecho y la liberación de factores que pueden promover la sobrevida y desarrollo de neuronas⁷⁶. Por el contrario, si la activación es exacerbada o crónica, las células del sistema inmune pueden producir estrés oxidativo, provocando neurotoxicidad y posteriormente, neurodegeneración⁷⁵. La microgliosis se considera uno de los primeros cambios que aparecen con el inicio de los DCP. En la EA, se cree que la formación del péptido A desencadena directamente la activación microglial⁷⁷. Por este motivo, las zonas donde inicialmente se deposita el A tanto en humanos como en modelos animales son las que muestran mayor activación de células microgliales (neocorteza, hipocampo y corteza entorrinal)^73,74,78,79. Esta activación se produce durante la transición de una placa difusa a una placa primitiva⁸⁰, formas que adoptan los agregados de A conforme se desarrolla la enfermedad. El A puede atraer y activar a la microglía, generando una acumulación microglial alrededor de los depósitos^81,82. Posiblemente, la microglía actúe de forma fagocítica para eliminar las placas amiloidogénicas^83-86.

Por otra parte, la microglía puede expresar receptores de adhesión a A fibrilar, lo que conduce a la liberación de ERO, secreción de interleuquinal (IL-1), IL-6, factor de necrosis tumoral- y quimioquinas^71,72,87. Del mismo modo ocurre en la activación inmune típica de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob⁸⁸. La activación de la microglía y la posterior liberación de factores relacionados con la inflamación son beneficiosas para frenar el desarrollo de la enfermedad. La ausencia de microglía en modelos murinos de la EA provoca un incremento en la formación de placas amiloides y muerte neuronal⁸⁹.

Por otro lado, los astrocitos juegan un papel esencial en el proceso inflamatorio que ocurre en la EA y en las EET, actuando de forma similar a como lo hace la microglía. Estas células se concentran en las regiones de depósito de las placas de Ay PrP^Sc, secretando factores pro-inflamatorios, como cito-quinas, prostaglandinas, leucotríenos, factores de coagulación, óxido nítrico sintasa y ERO^90,91. Su infiltración y acumulación alrededor de las placas, al igual que la microglía, permite la fagocitosis de los péptidos amiloides^91-94, manteniendo un balance entre la producción y la eliminación del péptido. En la corteza entorrinal, en el hipocampo y en el subículo de pacientes que padecen de la EA, se ha encontrado una correlación positiva entre el número de placas amiloides y el número de astrocitos⁹⁵, indicando la importante función que estas células ejercen. En relación a los ovillos neurofibrilares formados por la proteína tau hiperfosforilada, sólo se han correlacionado con la cantidad de astrocitos en la corteza entorrinal. Adicionalmente, mientras que la densidad del número de placas no se correlaciona con la severidad de la EA, sí lo hace el número de astrocitos inmu-norreactivos tanto en la corteza entorrinal como en el hipocampo⁹⁵. Se ha descrito que la presencia de IL-1 promueve la activación de los astrocitos mediante el ligando de CXCR3 en las patologías producidas por priones⁹⁶. Estos estudios muestran que cambios en la expresión de ligandos CXC pueden ser detectados en estadios asintomáticos de las EET, lo que sugiere que estas quimioquinas podrían ser factores importantes que promueven la neurodegeneración en las enfermedades desen cadenadas por priones^97,98.

Aún se desconoce si la neuroinflamación es una consecuencia secundaria al proceso neurodegenerativo o es una de las causas que podrían provocar su aparición y desarrollo. La contribución de la neuroinflamación a la disfunción y progresión de estas enfermedades aún no ha sido completamente estudiada, aunque gran parte de los estudios realizados hasta el momento apuntan a que su función es crucial en el proceso neurodegenerativo. Por este motivo, se han realizado un gran número de investigaciones con el propósito de analizar la posible relación entre el uso de drogas anti-inflamatorias y una menor probabilidad de desarrollar algún tipo de DCP, incluso, planteando el uso de estos fármacos como una posible terapia para disminuir los síntomas asociados en la EA. Datos epidemiológicos han mostrado una menor prevalencia de la EA en pacientes medicados regularmente con drogas anti-inflamatorias no estero ideas (AINEs)^99-101. Adicionalmente, análisis experimentales han reportado una disminución tanto en la sintomatología como en la acumulación de placas amiloides en forma independiente a la actividad de la ciclo-oxigenasa tras la administración de ibuprofeno¹⁰²¹⁰⁴. Sin embargo, estudios recientes muestran resultados contradictorios, posiblemente debido a que una adecuada respuesta inmune, aunque no crónica, es beneficiosa en el inicio de la enfermedad^105,106.

Conclusiones

Se han propuesto múltiples mecanismos por los cuales los agregados proteicos conducen a los daños tisulares y la posterior manifestación clínica, incluyendo la pérdida de la función normal de la proteína, la ganancia en toxicidad de las nuevas conformaciones y la inducción de procesos inflamatorios. Actualmente, no se ha descrito ningún mecanismo que explique satisfactoriamente la degeneración tisular asociada a estos desórdenes. Es posible que la suma o acumulación de estos eventos sea la causa de la neurodegeneración y la posterior manifestación clínica que en muchos casos termina en la muerte del individuo.

Hoy en día, se están realizando grandes esfuerzos enfocados a combatir estas enfermedades. Éstos incluyen la inmunización activa o pasiva^107,110 y estrategias no inmunológicas, como inhibidores de secretasas¹¹¹ y compuestos anti-agregación¹¹². La manipulación del sistema inmune con el propósito de erradicar los agregados proteicos ha sido ampliamente estudiada como estrategia terapéutica para la EA desde hace ya varios años¹¹³. En este momento, para las EET, las estrategias inmuno-terapéuticas abarcan desde anticuerpos contra la p_rpsc i na 15 hasta Ja obtención de células involucradas en la eliminación de este agregado¹¹⁶. Adicionalmente, en la EA, la inhibición farmacológica de las enzimas responsables de la formación del A (y- y -secretasa) es una estrategia importante para bloquear la producción de este amiloide¹¹¹. El estudio de los mecanismos que regulan la agregación proteica, como también los efectos tóxicos de las proteínas implicadas en los DCP, es crucial para desarrollo de terapias para tratar o prevenir este tipo de enfermedades.

 

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Recibido el 24 de enero de 2012, aceptado el 11 de julio de 2012

Conflictos de Intereses: Los autores de este trabajo no tienen conflictos de intereses que declarar.

Correspondencia:
Dr. Rodrigo Morales.
Mitchell Center for Alzheimer's disease and related Brain Disorders,
Department of Neurology, University of Texas Medical School at Houston,
6431 Fannin Street, Houston, Texas, 77030, USA.
Fax: 1-713-500-0773
E-mail: Rodrigo.MoralesLoyola@uth.tmc.edu.

 

Conflicto de intereses:

Claudia Duran-Aniotz

Ines Moreno-Gonzalez

Rodrigo Morales