Abstract 

Introduction

Rapid, reliable and accurate molecular typing methods are essential for outbreaks detection and infectious diseases control, for monitoring the evolution and dynamics of microbial populations, and for effective epidemiological surveillance. The introduction of a novel method based on the analysis of melting temperature of amplified products, known as High Resolution Melting (HRM) since 2002, has found applications in epidemiological studies, either for identification of bacterial species or molecular typing, as well as an extensive and increasing use in many research fields. HRM method is based on the use of saturating third generation dyes, advanced real-time PCR platforms, and bioinformatics tools

 

To describe, by a comphrehensive review of the literature, the use, application and usefulness of HRM for the genotyping of bacterial pathogens in the context of epidemiological surveillance and public health

 

A literature search was carried out during July-August 2016, by consulting the biomedical databases PubMed/Medline, Scopus, EMBASE, and ISI Web of Science without limits. The search strategy was performed according to the following keywords: high resolution melting analysis and bacteria and genotyping or molecular typing. All the articles evaluating the application of HRM for bacterial pathogen genotyping were selected and reviewed, taking into account the objective of each study, the rationale explaining the use of this technology, and the main results obtained in comparison with gold standards and/or alternative methods, when available

 

HRM method was extensively used for molecular typing of both Gram-positive and Gram-negative bacterial pathogens, representing a versatile genetic tool: a) to evaluate genetic diversity and subtype at species/subspecies level, based also on allele discrimination/identification and mutation screening; b) to recognize phylogenetic groupings (lineage, sublineage, subgroups); c) to identify antimicrobial resistance; d) to detect and screen for mutations related to drug-resistance; e) to discriminate gene isoforms. HRM method showed, in almost all instances, excellent typeability and discriminatory power, with high concordance of typing results obtained with gold standards or comparable methods. Conversely, for the evaluation of genetic determinants associated to antibiotic-resistance or for screening of associated mutations in key gene fragments, the sensitivity and specificity was not optimal, because the targeted amplicons did not encompass all the crucial mutations

 

Despite the recent introduction of sequencing-based methods, the HRM method deserves consideration in research fields of infectious diseases, being characterized by low cost, rapidity, flexibility and versatility. However, there are some limitations to HRM assays development, which should be carefully considered. The most common application of HRM for bacterial typing is related to Single Nucleotide Polymorphism (SNP)-based genotyping with the analysis of gene fragments within the multilocus sequence typing (MLST) loci, following an approach termed mini-MLST or Minim typing. Although the resolving power is not totally correspondent to MLST, the Simpson’s Index of Diversity provided by HRM method typically >0.95. Furthermore, the cost of this approach is less than MLST, enabling low cost surveillance and rapid response for outbreak control. Hence, the potential of HRM technology can strongly facilitate routine research and diagnostics in the epidemiological studies, as well as advance and streamline the genetic characterization of bacterial pathogens

 

 

 

I metodi di tipizzazione molecolare sono essenziali per il rilevamento di focolai epidemici, per monitorare l’evoluzione e le dinamiche delle popolazioni microbiche, quindi, per una efficace sorveglianza epidemiologica delle malattie infettive. A partire dal 2002, l’introduzione di un metodo basato sull’analisi della temperatura di melting dei prodotti amplificati, noto come High Resolution Melting (HRM), ha trovato numerose applicazioni negli studi epidemiologici, sia per l’identificazione delle specie batteriche, sia per la tipizzazione molecolare, così come un ampio utilizzo in molti ambiti di ricerca. Il metodo HRM si basa sull’uso di molecole intercalanti di terza generazione, di piattaforme avanzate di real-time PCR e strumenti bioinformatici per l’analisi dei dati

 

In questo studio, attraverso una revisione sistematica della letteratura, sono descritti l’uso, l’applicazione e l’utilità dell’HRM per la genotipizzazione dei batteri patogeni nel contesto della sorveglianza epidemiologica in Sanità Pubblica

 

La revisione della letteratura è stata condotta nei mesi di luglio e agosto 2016, consultando le principali banche dati: PubMed/Medline, Scopus, EMBASE e ISI Web of Science. La strategia di ricerca è stata eseguita secondo le seguenti parole chiave: high resolution melting e batteri e genotipizzazione o tipizzazione molecolare. Sono stati, quindi, selezionati ed esaminati tutti gli articoli che avevano valutato l’uso dell’HRM per la genotipizzazione di batteri patogeni, tenendo conto dell’obiettivo di ogni studio analizzato, il razionale per l’utilizzo di tale tecnica ed i principali risultati ottenuti rispetto ai metodi considerati "gold standard" e/o altri metodi alternativi, quando disponibili.

 

Il metodo HRM è stato ampiamente utilizzato per la tipizzazione molecolare sia di batteri patogeni Gram-positivi, sia Gram-negativi, rappresentando una metodologia molecolare versatile ed utile: a) per valutare la diversità genetica degli isolati e per tipizzare a livello di specie e sottospecie, anche sulla base della discriminazione allelica e/o dell’identificazione di mutazioni puntiformi; b) per riconoscere gruppi filogenetici (lineage, sublineage, sottogruppi); c) per determinare la resistenza agli antimicrobici; d) per identificare mutazioni legate alla resistenza ai farmaci; e) per discriminare isoforme geniche. L’HRM ha mostrato, in quasi tutti i casi, un’eccellente tipizzabilità e un ottimo potere discriminante, con un’elevata concordanza dei risultati di tipizzazione ottenuti con metodi “gold standard” o altri approcci. Tuttavia, nella valutazione dei determinanti genetici associati alla resistenza agli antibiotici o per lo screening di mutazioni ad essa associate, la sensibilità e la specificità non sono sempre state ottimali, poichè gli ampliconi non sempre comprendevano le mutazioni cruciali

 

Nonostante la recente introduzione di metodi basati sul sequenziamento, l’HRM merita una notevole considerazione nello studio dell’epidemiologia molecolare delle malattie infettive, essendo caratterizzato da basso costo, rapidità, flessibilità e versatilità. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni nello sviluppo dei saggi che, comunque, devono essere considerate con attenzione. L’applicazione più comune dell’HRM per tipizzare i batteri si riferisce alla genotipizzazione basata su mutazioni puntiformi (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) attraverso l’analisi di frammenti genici di loci utilizzati nella tecnica multilocus sequence typing (MLST), seguendo un approccio chiamato mini-MLST o Minim-typing. Anche se il potere di risoluzione non è del tutto corrispondente a quello ottenuto con l’MLST, l’indice del potere discriminante fornito dall’HRM in genere è stato > 0,95. Inoltre, il costo di tale approccio è inferiore all’MLST, consentendo di effettuare una sorveglianza a costi ridotti e allo stesso tempo fornendo risposte rapide in caso di focolai epidemici. Pertanto, il potenziale della tecnologia HRM può fortemente facilitare lo studio dell’epidemiologia molecolare delle malattie infettive e semplificare la caratterizzazione dei batteri patogeni